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步驟 1：上樣

潤洗后的內管放入全新收集外管，移液槍緩慢加樣品，槍頭嚴禁戳碰濾膜，液面不超最大刻度。

步驟 2：配平離心（重中之重）

1. 天平配平，對稱放入轉子；角轉子：濾膜面朝上擺放；水平轉子無朝向要求。

2. 蓋緊全套管蓋，按廠家推薦離心力：

1. 4 mL/15 mL 大容量：3000–5000 × g

2. 0.5 mL 微量超濾管：8000–12000 × g 嚴禁超過管壁標注最大 RCF，高速會撕碎濾膜、蛋白變性。

3. 分段離心：每次 10–15 min，取出觀察截留液體積，禁止一次性長時間離心干膜。

步驟 3：脫鹽 / 緩沖液置換（可選）

1. 樣品濃縮至 100–200 μL；

2. 加入足量新目標緩沖液（體積為截留液 5–10 倍）；

3. 重復離心濃縮；循環 2–4 次，可置換 95% 以上原有緩沖鹽離子。

步驟 4：樣品回收（兩種方法）

方法 1：移液吸取（常規）

冰上操作，槍頭沿管壁伸入液面，輕柔吹打管壁側殘留蛋白，不觸碰底部濾膜，全部吸出截留液。微量樣品可用少量緩沖液潤洗管壁二次回收。

方法 2：倒置離心（高回收率，微量樣品推薦）

丟棄收集管濾液，將內管倒置套入新 EP 管，1000×g 低速離心 1–2 min，膜面截留樣品全部被甩出，回收率＞90%。

關鍵注意事項

1. 絕對禁止干膜 液體透過、濾膜干燥會導致蛋白不可逆吸附，樣品大量損失；多次短離心觀察體積。

2. 禁止槍頭、吸頭刮擦濾膜 膜破損會造成大分子全部穿透，實驗報廢。

3. 一次性超濾管不建議重復使用 同一種樣品短期復用可純水沖洗 + 20% 乙醇浸泡；交叉樣品嚴禁復用，殘留污染。

4. 化學兼容性 避免高濃度強堿、強氧化劑、高有機相長時間接觸膜；含 SDS 高濃度去污劑會破壞 PES 膜。

5. 無菌操作 細胞、病毒、無菌蛋白樣品全程超凈臺操作，緩沖液提前 0.22 μm 除菌過濾。